全国肠出血性大肠杆菌O157:H7
感染性腹泻监测方案（试行）
肠出血性大肠杆菌（EHEC）是近年来新发现的危害严重的肠道致病菌。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行。我国自1997年在一定范围内开展监测工作以来，已陆续有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽、腹泻病患者等分离出肠出血性大肠杆菌O157:H7，特别是1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。为确保早期发现、及时报告疫情，以迅速有效控制疫情，制定此监测方案。
一、监测目的
1．早期发现疫情；
2．动态观察O157:H7大肠杆菌的分布特征及疾病流行趋势；
3．评价各项干预措施的实施效果，为制定有效的防治对策提供依据。
二、监测内容与方法
（一）病例定义
具有以下表现之一者即为疑似病例：
1.1鲜血便或鲜血样便（血便相混）的腹泻病例；
1.2腹泻若干天后继发以少尿或无尿为先驱症状的急性肾功能衰竭（附件4）的病例。
疑似病例或其他腹泻病例，具有以下条件之一者即为确诊病例：
2.1用免疫磁珠法从粪便标本中检测出产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7（附件2）；或恢复期血清O157 脂多糖（LPS）IgG抗体呈4倍升高；或经蛋白印记试验证实血清标本有与O157 LPS、或肠出血性大肠杆菌溶血素、或志贺毒素分子量一致的特异性抗体（附件3）；
2.2在流行区内，经省级专家组确认，与确诊病例流行病学密切相关，并排除其它疾病的疑似病例，为临床符合病例；
2.3腹泻病例的粪便中分离出不产志贺毒素1或志贺毒素2及其变种的肠出血性大肠杆菌O157:H7，亦为确诊病例（不产毒）。
3暴发疫情
3.1在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于10例的具有显著的流行病学联系，且无其它原因可解释的疑似病例；
3.2在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于3例的确诊病例。
（二）监测内容与方法
各省、自治区、直辖市根据具体情况，针对疫情的流行特征开展以病例监测为主、疑
似病例搜索为重点的病例监测工作，必要时开展对外环境、动物宿主（家畜、家禽）及食品的专题调查。在确认发生暴发或流行的疫区，或疫情可能波及的地区除重点开展病例监测外，可有针对性地开展对外环境、传染源及传播途径等的综合性监测。
2.监测范围与监测点的确定
2.1监测范围由各省、自治区、直辖市根据本地的具体情况确定；
2.2 监测点设置应以县（区）为单位，监测点数量以及分布由各省、自治区、直辖市根据本地的具体情况确定；
2.3在已发现确诊病例或疑似病例的地区、或人群处于高危状态（人口稠密、人口流动频繁、与流行区毗邻等），且具有开展条件（如经济发达、经费充足、组织机构完善、医疗服务网点分布相对集中）的地区，可选择在县级以上的综合医院，设置以肠道门诊、泌尿科和儿内科为重点的常规监测点；
2．4在肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻流行区，可选择乡级以上医疗、卫生防疫机构开展哨点监测。
3．监测方法
3.1 病例监测
各级各类医疗、卫生防疫机构的医疗卫生人员一旦发现肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻疑似病例，按照下列步骤开展工作。
内 容 |
步 骤 |
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标本采集与报告 |
1) 报告单位应指定专人负责疫情报告，发现疑似病例及时填报“肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻专用疫情报告卡”（附表1），并报告同级卫生防疫机构；
2) 有采样条件的报告单位，按要求（附件1－1）及时采集足量的粪便及血标本；
3) 无采样条件的报告单位，应挽留疑似病例，并尽快报告当地卫生防疫机构前来采集标本；及时、准确地填写“疑似病例标本送检表”（附表2），在规定时限内将标本及其送检表一并报送病例发生地的卫生防疫机构。 |
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标本运送 |
病例发生地的卫生防疫机构须按规定妥善保存标本，并于采样后3日内将标本及其送检表送达指定的送检单位（省级实验室或有条件的省级以下实验室）。 |
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标本鉴定
与结果反馈 |
指定的送检单位须在收到标本1周内完成标本鉴定，并于1周内将标本鉴定结果逐级反馈到病例报告单位。 |
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疫情调查
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卫生防疫机构在接到报告后应尽快赶到疫情发生地，开展病例个案调查（附表3），核实诊断，并根据疫情流行情况在适当范围开展相关疑似病例的搜索，必要时可开展对外环境、传染源及传播途径的专题调查。 |
在人口稠密、外环境污染严重、卫生状况较差、肠道传染病发病率较高，家畜、家禽的种类与数量较多的农村，若发现肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的确诊病例或较多的疑似病例，并高度怀疑在外环境或动物宿主中存在传染源，为及时查明病因，应开展病例发生地周围环境及动物宿主的流行病学专题调查。
此项监测是在卫生监督以及畜牧部门的配合支持下，采集家畜、家禽（如牛、羊、鸡、猪等）、动物养殖厂种畜、种禽（特别是进口种畜、种禽）的粪便标本，及时分离鉴定菌株。若有条件还应收集鉴定动物血清标本。
各级卫生防疫部门与卫生监督部门密切配合，共同有组织、有计划地开展对可能被污染的动物性食品、乳制品及蔬菜、水果、饮料等进行监测。
（三）疫情报告
各级医疗、卫生防疫机构发现疑似或确诊病例时，可参考《传染病防治法》中乙类传染病的报告程序和时限，通过当地卫生防疫机构逐级报告至省级，并填报“肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻”专用疫情报告卡；各级卫生防疫机构在向上一级卫生防疫机构报告的同时，应报告同级卫生行政主管部门，并逐级报告到省。省卫生防疫机构按月向中国预防医学科学院报告疫情（见附表4－6）。
2．首发病例报告
各省、自治区、直辖市每年发生第一例肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻疑似或确诊病例时，省、自治区、直辖市卫生防疫机构在向省级卫生行政部门报告的同时，向中国预防医学科学院报告。
各地一旦发现肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻暴发或疑似暴发疫情，当地卫生防疫机构应以最快的通讯方式逐级报告至省级；各级卫生防疫机构在向上一级卫生防疫机构报告的同时，应报告同级卫生行政主管部门；卫生行政主管部门接到报告后，应报告同级地方人民政府，并同时向上一级卫生行政部门报告；省级卫生行政部门要按照卫办发（1999）第382号文的要求在接到暴发疫情后6小时内向卫生部报告。
（四）疫情调查
疫情发生后，辖区的卫生防疫机构要对发病现场的确诊病例进行个案调查（见附表3），并在疫情可能波及的范围内开展相关疑似病例的搜索，调查和采样，尽快核实诊断、追溯传染源，确定疫点范围，及时采取控制措施。必要时开展传染源、传播途径及暴露因素的专题调查。
2．暴发疫情调查
接到暴发疫情报告后，卫生行政部门应按《肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻应急预案（试行）》（另发）的规定，立即组织有关卫生防疫、医疗、卫生监督机构赶赴暴发现场，按以下步骤及时开展疫情调查：核实诊断→确认暴发→采取措施→资料分析→评价效果→总结报告。
三、监测资料管理与监测工作评价
（一）疫情资料管理
各级各类医疗卫生机构、卫生监督部门须密切配合，确保及时、准确的报告疫情。各级卫生防疫部门负责监测技术和资料的统一管理。
1.监测资料的收集、整理、分析、反馈及质量控制实行分级管理。各级卫生防疫机构要准确汇总、分析辖区内的疫情资料，及时上报本级卫生行政主管部门和上级卫生防疫机构，并向下级卫生行政主管部门和卫生防疫机构进行反馈。
2.要准确、完整地填写“肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻疫情专用报告卡及疑似
病例标本送检表”，并于收到标本鉴定结果后1周内，将“肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻疑似病例标本送检表”，及时上报至省级卫生防疫机构。省级卫生防疫机构在收到报表后3日内将报表结果汇总于表4，建议采用Microsoft EXCEL的表格形式录入数据，表格格式和数据表达编码要与《方案》的标准格式保持完全一致。文件名的格式为：“××省×月O157报表.xls”。于每月的25日前通过计算机联网传送或其他适宜方式将表4报至中国预防医学科学院。
3.确诊病例个案调查表均由省级卫生防疫机构统一填写调查表，并及时按标准的数据格式录入数据库，每年向中国预防医学科学院汇总报告一次。
4.各级卫生防疫机构须在规定的期限填报附表5、6或7，并于每月25日前完成上月资料汇总，逐级报告至中国预防医学科学院。
（二）监测工作评价指标
1.疫情报告的及时性、完整性和准确性；
2.确诊病例的敏感性和特异性；
3.疫情调查和处理的及时性；
4.标本采集和运送合格率；
5.实验室检测结果及时反馈率；
6.控制续发病例的有效性。
四、组织与实施
各省、自治区、直辖市卫生厅（局）负责疫情监测与疫情控制的组织工作，省级卫生防疫与卫生监督机构共同负责具体实施。中国预防医学科学院负责省级监测工作的人员培训、技术指导和系统评价，并加强监测工作实施的检查和质量控制。
五.开展监测工作的要求
1、实行分级管理，定期开展疫情资料的收集、分析和反馈；
2、实行逐级培训，有目的、有重点地开展对各级各类医疗、卫生防疫机构和人员的培训工作，提高卫生防疫人员的疫情监测、调查和处理能力；提高临床医师识别疑似病例和确诊病例的技能，鼓励临床医师主动搜索疑似病例，并掌握报告程序及确诊方法，确保病例报告的及时性和完整性。
3.定期开展主动监测和漏报调查，发现问题及时纠正，并尽快报告同级和上级卫生防疫机构，采取补救措施。
4、凡具备检测能力的单位（已经过中国预防医学科学院培训），须在鉴定后10日内将每一例确诊病例的标本及其送检表报送省级实验室进行确认。
5.被省级实验室确诊病例的血清及菌株，应在鉴定后10日内送往中国预防医学科学院流
研所复判（分型和鉴定）。所有疑似病例的确诊，均以省级以上专家组的确诊结论为准。
6.各地对所发生的“疑似暴发疫情”及“暴发疫情”调查和处理后，要在1个月内向卫生部报告调查和处理结果，同时抄报中国预防医学科学院。
附件：
1．采样送检及菌株分离
1)病人粪便标本采集：以采集腹泻病人血性水样便为主。可用无菌棉拭采集新鲜血性大便，亦可用棉拭子插入直肠内3－5厘米处采集。肛拭标本应染有粪便。水样便要采集1－3毫升，成形便要采集相当于拇指末节大小的粪量；
2)腹泻病人血性水样便标本从采集到送检不得超过24小时，采集的标本应插入卡里-布莱尔半固体保存培养基中，立即送实验室接种于培养基。培养基要定期调换，保持培养液新鲜；
3)临床症状典型的患者或首例患者必须采集血清标本,至少收集一部分双份血清标本。首例患者必须提供双份血清。每份血清最少1毫升；
4)水、食品、环境标本采集后，应在24小时内送至实验室进行增菌、培养、分离；
5)样品检验单应填写完整，与样品一起送实验室。样品检验表见附表。必须提供与分离菌株相对应的患者的临床资料和流行病学资料；
6)使用免疫磁珠富集技术和山梨醇麦康开琼脂或科玛嘉琼脂分离肠出血性大肠杆菌O157：H7；按照山梨醇不发酵、O157：H7特异性血清初筛、生化反应鉴定和PCR鉴定的程序进行肠出血性大肠杆菌O157：H7的初筛和鉴定;初筛阳性的菌落和可疑菌落应该保存下来, 交中国预防医学科学院流研所进行分子生物学鉴定和分型。
2．送交鉴定和分型菌株的要求
1)经过分纯的没有污染的菌株;分离菌株应该用甘油半固体保存；
2)与分离菌株相对应的患者血清,第二份血清应在发病后14～21天采集；
3)与分离菌株相对应的患者的临床症状和流行病学资料；
4)当地的肠出血性大肠杆菌O157:H7或EHEC的分离率资料。
附件2： 粪便标本肠出血性大肠杆菌O157:H7的分离方法
包括标本采集和增菌、免疫磁珠富集和培养、生化反应、血清学和毒力因子鉴定。
1．粪便标本增菌
1)采集的标本应插入卡里－布莱尔半固体保存培养基中，立即送实验室接种于增菌培养基（EC肉汤+10mg/L新生霉素或Tryptic Soy Broth）；
2)增菌培养：增菌液可用添加10mg/L新生霉素的EC肉汤；也可用1/8N 的HCl+0.5%NaCl溶液，将标本处理30秒后，再用胰大豆胨培养液增菌。
2．免疫磁珠富集方法
1)取下磁板，然后将事先编号的1.5ml离心管置于Dynal MPC－M架上；
2)重新悬浮E.coli O157的Dynal磁珠,直到底部的沉淀消失。吸取抗E.coli O157磁珠， 每管20ul；3)取1ml增菌培养物的标本, 加入管中，然后盖紧管，每加一个样品,都要换新管；
4)颠倒Dynal架几次, 然后在室温条件下, 置于 Dynal MX3样品混合器上,不断轻轻搅动,以阻止磁珠沉淀,持续时间10分钟（如果没有混合器，可人工混合）；
5)将磁板插入到Dynal MPC－M上颠倒支架数次，以浓缩磁珠沉淀到管壁，作用持续3分钟；
6)用配套的开盖器打开试管，小心的吸取悬浮液（包括残留在管盖上的液体），并弃掉（请检查影响产物出现的因素）；
7)将磁板从Dynal架取下；
8)加入1ml洗涤缓冲液（PBS—吐温），吸管不要接触小离心管，以免造成样品及缓冲液的交叉污染；然后盖上盖，将Dynal MPC－M架颠倒数次，以重新悬浮磁珠；
9)重复5－8的步骤；
10)重复5－7的步骤；
11)用100微升冲洗缓冲液（PBS－吐温）重新悬浮磁珠细菌混合物。用一个混合器做短暂的混匀。此为富集的肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌悬液；
12)将上述菌悬液划线接种于CT－山梨醇麦康凯（C－头孢菌素类抗生素、T－亚碲酸钾）等选择性培养基上，370C培养16～24小时。
3．生化反应、血清学和毒力因子鉴定
1)生化反应鉴定：将疑似肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌落进行生化反应。若生化反应特点符合大肠杆菌的鉴定标准，进行血清学鉴定；
2)血清学鉴定：使用O157和H7特异性抗体，使用玻片凝集方法进行鉴定。血清学鉴定为O157：H7、O157：H-的菌株，进行毒力因子鉴定；
3)毒力因子鉴定：包括对EHEC特异性溶血素 基因、志贺毒素1、志贺毒素2、志贺毒素1和2 的变种、EHEC特异性的eae基因的检测。可使用PCR方法进行。所使用的引物，必须是国内或国际公认的、已经发表的引物。在使用PCR方法进行鉴定时，在同一次PCR试验中， 必须同时包括阳性对照和阴性对照。只有在阳性对照和阴性对照的PCR试验经过分别是阳性和阴性时，所检测标本的试验结果才具有诊断意义。
肠出血性大肠杆菌O157：H7的检验程序
粪便或其它标本
增菌6小时左右
磁珠浓缩
山梨醇—麦康开
培养基培养18-24小时
可疑菌落
革兰氏 生化 血清学 毒力因子
染色 反应 鉴定 鉴定*
根据结果判定
* 有条件的单位可进行，如用PCR检测SLT1 、SLT2、Hly、EAE的基因
注：1）培养及增菌均在37℃进行；
2）山梨醇-麦康凯培养基中应加入适当的抑菌剂；
3）“科玛嘉”培养基加入亚碲酸钾后选择效果更好；
4）在SMAC中加入下列抑制剂的一种均可增加培养基的选择性；
a) 亚碲酸钾2.5mg/l 和先锋霉素类抗生素Cefixime 0.05mg/l；
b) 新生霉素10mg/l；
c) 万古霉素40mg/l；
5）在科玛嘉或S--MAC平板上挑选可疑菌落与O157诊断血清、H7血清或O157单克隆抗体作试探性凝集试验，若不凝集，但临床表现疑为EHEC感染，则应做如下处理。因为个别肠出血性大肠杆菌O157：H7具有K抗原，应在生化反应确定为大肠杆菌后用生理盐水制备菌悬液，并100℃水浴加热10-15分钟再与O157诊断血清或O157单克隆抗体做凝集试验；
6）当生化反应和血清学反应结果均与肠出血性大肠杆菌O157：H7符合时，才能确认为肠出血性大肠杆菌O157：H7；
7）目前许多国家使用的O157和H7特异性抗体与及少数细菌具有不同程度的交叉反应，如美国、法国还有我国自己生产的试剂都与弗劳地枸橼酸杆菌有交叉反应，因此，用生化试验确定为大肠杆菌是必须的,最为重要的是硫化氢试验。绝大多数肠出血性大肠杆菌菌株在24小时内不能发酵D-山梨醇。但是， 也报道了一些能够快速发酵D-山梨醇的菌株；
8）典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：
a)动力试验 葡萄糖 麦芽糖 甘露醇 蔗糖 硫化氢 尿素试验
＋ ＋ ＋ ＋ +/－ － －
b)靛基质 甲基红 V-P试验 枸橼酸盐 苯丙氨酸脱氨酶
＋ ＋ － － －
c)赖氨酸脱羧酶 鸟氨酸脱羧酶 氧化酶 氰化钾
+/－ +/－ － －
附件3： 患者血清O157脂多糖和EHEC溶血素特异性抗体的检测方法
(免疫印记法[Western blot]）
目的是检测肠出血性大肠杆菌O157：H7感染患者血清中的O157 LPS和EHEC溶血素特异性抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维素膜上，然后用抗原抗体反应进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性。操作步骤为：
1．SDS-PAGE
1)根据所使用电泳槽的玻璃板的尺寸确定所需凝胶的体积。按比例配制14%的分离胶。加入TEMED后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。
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分离胶成分 |
检测LPS(14%) |
检测溶血素(10%) |
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三蒸水 |
2.6毫升 |
4.0毫升 |
|
30%丙烯酰胺 |
4.7毫升 |
3.3毫升 |
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1.5mol/LTris,pH8.8 |
2.5毫升 |
2.5毫升 |
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10%SDS |
0.1毫升 |
0.1毫升 |
|
尿 素 |
2.4克 |
------- |
|
10%过硫酸铵 |
0.1毫升 |
0.1毫升 |
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TEMED |
0.004毫升 |
0.004毫升 |
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总 量 |
10毫升 |
10毫升 |
2)制备浓缩胶其成分为
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三蒸水 |
2.7毫升 |
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30%丙烯酰胺 |
0.67毫升 |
|
1.0mol/LTris,pH8.8 |
0.5毫升 |
|
10%SDS |
0.04毫升 |
|
10%过硫酸铵 |
0.04毫升 |
|
TEMED |
0.004毫升 |
|
总 量 |
4毫升 |
3)在两块玻璃板的间隙灌注分离胶溶液，留出灌注浓缩胶和梳子的空间，在分离胶表面轻轻加盖一层三蒸水，防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合。将凝胶垂直放置于室温下，聚合；
4)分离胶聚合后清除覆盖的三蒸水。用滤纸条的边缘吸尽残留液体；
5)按比例配制合适体积的浓缩胶，在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶溶液，并立即在浓缩胶溶液中插入梳子，小心排尽气泡，将凝胶垂直放置于室温下，令其聚合；
6)在浓缩胶聚合时，将提纯的脂多糖或溶血素 2微升（0.5毫克/毫升）加入等量的2xSDS 凝胶加样缓冲液，100℃加热3分钟；
7)当浓缩胶聚合后，小心拔出梳子，用注射器吸取电泳缓冲液冲洗上样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺；
8)按顺序上样，90V恒压电泳3小时，至溴芬兰跑到凝胶边缘。跑好的胶可用于银染检查，也可用于转膜。
2．转移电泳
1)将分离胶从玻璃板上转移到转移缓冲液中浸泡20分钟；
2)严格按照分离胶的大小剪裁一张硝酸纤维素膜和12张滤纸，并浸泡在转移缓冲液中；
3)在电转移仪的底板上铺6层浸湿的滤纸，用玻棒赶出各层之间的气泡；
4)将浸湿的硝酸纤维素膜铺在滤纸上，赶出各层之间的气泡，并做好标记，以待试验结束后判断样品的位置和顺序；
5)将分离胶铺在硝酸纤维素膜上，赶出气泡，在胶上铺6层浸湿的滤纸，赶出气泡。注意不能让上层的滤纸直接接触到凝胶下的硝酸纤维素膜及滤纸，以防短路；
6)盖上转移仪的电极板及外盖，根据凝胶的面积按4毫安/平方厘米计算电流，恒流50分钟（转移时间是根据BIRO-RAD转移仪使用情况提供的，可根据不同的仪器， 设置时间）；
7)转移完成后，关闭电源，取出硝酸纤维素膜，浸在5%的脱脂奶粉中，室温震荡封闭2小时，或4℃过夜。
3．免疫检测
将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。
1)每条加入1毫升用PBS稀释的Ⅰ抗，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；
2)用2.5 毫升/条 PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；
3)加入用1 毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；
4)用2.5 毫升/条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次；
5)将膜放入 12毫升显色液中显色，室温震荡15－30分钟，至满意的蓝紫色条带出现为止（初次试验，要随时观察）；
6)将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；
7)只有显色的条带和溶血素的分子量或O157 LPS的条带谱一致时，才有诊断意义。
4．试剂和溶液的配制
1)主要试剂 SDS-PAGE
①30%丙烯酰胺 29克丙烯酰胺和1克N,N`-亚甲基双丙烯酰胺溶于60毫升三蒸水,加热 至37℃溶解,定容至100毫升,过滤后棕色瓶保存。
②10% SDS 10克SDS溶于90毫升三蒸水,加热至68℃溶解,定容至100毫升。
③10%过硫酸铵 将1克过硫酸铵溶于终量为10毫升的三蒸水，分装后，4℃或-20℃保存。
④1.5mol/L Tris ,PH8.8, 三蒸水配制, 过滤。
⑤1.0mol/L Tris ,PH6.8，三蒸水配制, 过滤。
⑥TEMED N，N，N`，N`-四甲基乙二胺。
⑦10X电泳缓冲液 800毫升蒸馏水中加入30.2克Tris，188克甘氨酸，10克SDS，溶解后补齐至1000毫升，使用时10倍稀释。
⑧2×SDS 凝胶加样缓冲液 100mmol/L Tris-HCl （PH6.8）
200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)
4% SDS
0.2% 溴酚兰
20% 甘油
2）转移电泳缓冲液 2.9克甘氨酸、5.8克Tris、0.37克SDS、200毫升甲醇、定容至1000毫升。
3）免疫检测溶液
A PBS 800毫升蒸馏水中加入8gNaCl，0.2gkCl，1.44gNa2HPO4，0.24gKH2PO4,PH7.2，定容至1000毫升。
B PBST 上述PBS中加入0.05%的Tween 20。
C Ⅰ抗 腹泻或肾衰病人血清
D Ⅱ抗 辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG,IgM。
E 显色液
A液；10毫升PBS中加入6微升30%双氧水
B液：2毫升冷甲醇中加入6毫克四氯一萘酚
将A、B溶液混匀，现配现用。
4）设备及材料 滤纸、 硝酸纤维素膜0.45um国产、 电泳槽（可使用BIRO-RAD MINI -III）、 电转移仪（可使用BIRO-RAD）、 稳压电源、 摇床、 EHEC溶血素和O157 LPS抗原（中国预防医学科学院流行病学和微生物学研究所可提供）。
附件4: 肠出血性大肠杆菌O157:H7感染病例诊断标准
【临床表现】
肠出血性大肠杆菌O157：H7主要引起出血性肠炎、溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜。潜伏期：1～9天，平均5～6天。
出血性肠炎（HC）的典型临床表现为：鲜血样便、 腹部痉挛性疼痛、低烧或不发烧。患者可表现为先水样腹泻，约数小时至1天后转为血性腹泻。部分病例可发展为溶血性尿毒综合症、血小板减少性紫癜，若抢救不及时，危及生命。
溶血性尿毒综合症（HUS）主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1～2周后，病例主要表现为血小板减少、溶血性贫血、急性肾功能衰竭三大特征。大多数HUS发生在急性腹泻之后，儿童和老人易感。病死率一般在10%，个别可高达50%，约30%幸存者可表现出慢性肾衰、高血压、神经系统损害等后遗症。
血栓性血小板减少性紫癜（TTP）主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、微血管异常、溶血性贫血、肾功能异常（包括血尿、蛋白尿、BUN或肌酐升高）、神经系统损害（如头痛、轻度瘫痪、昏迷、间歇性谵妄），病情发展迅速，病死率高，90天内可有70%的病人死亡。
【实验室检查项目】
a. 采集粪便标本， 立即使用免疫磁珠法进行O157：H7或非O157：H7肠出血性大肠杆菌的分离培养；
b. 采集血清标本，进行血清特异性抗体的检测。
c. 对可疑肠出血性大肠杆菌O157：H7感染患者，进行血、尿、便常规检查，进行血尿素氮、血清肌酐、淋巴细胞分类、血清乳酸脱氢酶、血小板、血红蛋白和尿量检查。
【实验室诊断依据】
有下列情况之一具有实验室确诊意义：
从腹泻病患者的粪便标本中分离出肠出血性大肠杆菌O157：H7或非O157：H7肠出血性大肠杆菌；
